案例展示研究背景小麦蓝矮病是我国西北麦区一种重要植原体病害,在我国西部地区危害严重。该病害由异沙叶蝉专化性传播,介体传*成为病害流行的重要中心环节。本实验室前期通过免疫荧光标记研究发现WBD植原体免疫膜蛋白与介体异沙叶蝉肌动蛋自互作,说明IMP在植原体传播和致病过程中起关键作用。本研究以WBD植原体IMP为诱佴,利用膜蛋白酵母双杂交技术筛选感染WBD植原体的异沙叶蝉膜系统cDNA文库,筛选获得与异沙叶蝉互作的蛋白,以期为研究二者互作,进而通过阻断叶蝉传播途径控制病害发展。
研究方案
1.诱饵载体的构建及功能检测
根据WBD植原体IMP基因序列合成带有SfiⅠ酶切位点的诱饵序列,通过两端的酶切位点将目的基因构建到酵母双杂交的诱饵载体pBT3STE上。诱饵载体构建成功后,将pBT3STE-IMP+postl-NubI、pBT3STE-IMP+pPR3-N、pTSU2-APP+PNUBG-Fe65(阳性对照)和pTSU2-APP+pPR3N(阴性对照)通过LiAc的方法共转进酵母NMY32,在选择性培养基DDO(SD-Trp-Leu)、TDO(SD-Trp-Leu-His)、QDO(SD-Trp-Leu-His-Ade)上30°C培养3-4d观察菌落生长状态。2.诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库
将诱饵载体pBT3STE-IMP和文库质粒共转NMY32酵母菌中,将转化子克隆涂布在QDO选择培养基平板上,30℃培养箱培养3-4d。从筛库平板中挑取直径大于1.5mm的单菌落,重复3次依然生长的克隆判定为阳性克隆。3.二次互作验证及生物信息学分析
为避免假阳性,将获得的阳性酵母单克隆挑取后重新在QDO选择培养基上培养。对继续生长的阳性单克隆菌落进行β-半乳糖苷酶检测,β-半乳糖甘酶活性大于阴性对照则认为通过LacZ报告基因的检测。将阳性克隆质粒从酵母细胞中回收并测序,测序结果在NCB1BLASTX比对,同时进行GeneOntology(GO)注释以及KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)通路分析。研究结果1.诱饵载体的构建及功能检测WBD植原体IMP具有2个跨膜区影响其在大肠杆菌中表达。因此本试验切除了跨膜区,对bp的核心序列以及两端的SfiⅠ酶切位点进行全基因合成,诱饵质粒测序表明插入序列完全正确,载体构建成功。功能检测结果显示:pBT3STE-IMP+pOstⅠ-Nubl在DDO、TDO、QDO培养基均能生长，说明诱饵载体在酵母中正确表达,激活下游报告基因:pBT3STE-IMP+pPR3-N不能在TDO、QDO培养基上生长,表明诱饵载体无自激活活性。2.诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库将诱佴载体pBT3STE-IMP与异沙叶蝉文库质粒共转酵母NMY32后得到的总菌落数为1.2×10^6CFU,转化效率为4.8×10^4CFU,符合文库筛选条件。诱饵载体从异沙叶蝉cDNA文库中筛选得到30个阳性克隆。测序结果经NCBI比对、分析,获得13个基因的非全长序列,编码8种候选蛋白。二次共转验证和B-半乳糖苷酶检测显示8种候选蛋白与WBD植原体IMP互作。3.生物信息学分析GO注释分析表明8种互作蛋白参与包括线粒体的电子运输、蛋白质折叠,基于微管蛋白的生物过程、信号转导、ATP合成、核酸代谢过程等;分子功能包括GTP酶活性、细胞骨架结构分子活性、质子跨膜转运、顺反异构酶活性、蛋白 酶活性等。8种互作蛋白存在线粒体、核糖体、细胞骨架和细胞质中。参考KEGG数据库,这些蛋白参与内吞作用、能量代谢、运输和分解代谢通路等。膜系统原理
DUALmembrane系统(DUALmembranesystem)首先由瑞士的DualsystemsBiotechAG公司开发出来，是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，泛素可以分成两部分表达，即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub)，后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白体系，断裂的泛素的两部分分别连接一个蛋白，且两个蛋白之间存在相互作用。它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，使得分析膜蛋白间的互作成为现实。
技术优点
在体内原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号
使用小的泛素结构域(NubG/Cub)使得相互作用蛋白质之间的空间位阻最小化
此体系可以用来研究两个膜蛋白的相互作用和一个膜蛋白与一个胞质蛋白的相互作用任何一种膜蛋白都能作为诱饵，能使与待检测蛋白融合的相互作用模块(Cub-PLV-NubG)定位细胞质内
蛋白间的互作信号靠泛素特异性结合蛋白(UBPs)剪切人工转录因子(LexA)启动，而不是靠转录，因此可以检测蛋白自身的转录激活或抑制序列
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