以CRISPR/Cas系统为代表的基因编辑技术是实现种子 设计的关键技术，更是下一代核心生物育种技术。植物基因编辑的一个关键步骤是将Cas9蛋白和sgRNA递送到植物细胞中发挥作用,目前植物中的递送方式主要有农杆菌和基因枪转化两种，都需要通过繁杂的组织培养和再生才能获得完整的突变体植株。然而，组织培养和再生仍然是植物基因编辑的限速步骤，对于一些单子叶植物，尤其对于包含庞大且复杂的六倍体基因组的普通小麦，其基因编辑尤为困难(Gao,;Ranetal.,)。因此，商业化的小麦基因编辑服务价格依然相当高昂。虽然基于农杆菌转化的小麦基因编辑在一些特定基因型的小麦中具有相对较高的效率，但需要获得日本烟草公司的专利授权。开发无需组织培养且不受基因型限制的递送系统是植物基因组编辑需要解决的关键技术问题。
近年来研究人员尝试利用植物RNA病*作为载体，进行Cas9和/或sgRNA的递送，用于植物基因编辑，称为病*介导的基因编辑(Virus-MediatedGeneEditing,VMGE)。如基于SYNV(Sonchusyellownetrhabdovirus)的VMGE载体,可以同时递送Cas9蛋白和sgRNA，对本氏烟草的内源基因进行编辑(Maetal.,)，然而该系统目前只能应用于双子叶植株本氏烟草，并且需要通过组培和再生才能获得完整的基因编辑植株。此外，Ellison等人()在一种基于TRV的VMGE载体的基础上，通过融合可移动RNA元件（AtFT/tRNA），在双子叶植物本氏烟草中实现了高效的可遗传基因编辑，绕开了组培和再生(Ellisonetal.,)。开发病*载体系统对遗传转化较为困难的小麦实现高效的无需组织培养的基因组编辑递送，对小麦基因功能研究和性状的 改良具有重要的意义。
年7月15日，MolecularPlant发表了题为HighlyefficientheritablegenomeeditinginwheatusinganRNAvirusandbypassingtissueculture的研究论文。该研究开发了基于大麦条纹花叶病*(BSMV)的sgRNA递送载体系统BSMV-sg,在小麦中实现了可遗传且无需组织培养和再生的基因组编辑。
1.改造病*载体以期促进可遗传的编辑效率
首先在BSMVγ-sg载体的基础上，构建了包括在sgRNA的5’或3’上连接tRNA和/或FTRNA移动元件(来源于拟南芥的mAtFT和小麦的mTaFT)的6套不同改造载体(图1A)。将这7套载体分别接种处于营养生长中后期的Cas9转基因小麦(M0代)，待发病小麦结实后，直接收获种子并对子一代(M1代)植株进行基因编辑情况的检测(图1B)。该研究对病*接种时期进行了优化，由此前的2-3叶期接种优化为在拔节期接种小麦，以降低BSMV对植物正常生长和结实的负面效应。
图1.七套基于BSMV的基因编辑载体系统及接种流程示意图
2.病*载体在接种M0代小麦叶片中的基因编辑效果
进而测试7套载体在接种当代的基因编辑效果，发现相较于BSMV-sg，除BSMV-sg-mTaFT之外，其他5种改造载体的侵染效率均出现不同程度的下降。高通量测序(Next-generationsequencing,NGS)检测发现,各载体均能在小麦系统发病叶片实现基因编辑，效率在3.8%-96.1%，其中BSMV-sg,BSMV-sg-mTaFT和BSMV-sg-mAtFT三套载体的效率较高并可在系统叶片中引发明显的白化表型。进一步研究发现，未引入可移动RNA元件的BSMV-sg及在sgRNA的3’端引入mTaFT元件的BSMV-sg-mTaFT载体均可在三种不同品种(Bobwhite、郑麦和Fielder)的Cas9转基因小麦的不同靶点上实现高效的基因编辑(图2)。
图2.基于BSMV的各载体系统可在小麦接种M0代实现高效的基因编辑
3.在病*接种后代(M1代)可产生高效的可遗传的编辑
二代测序结果分析M1代幼苗表明，未加入可移动RNA元件的BSMV-sg载体系统，可在三种不同品种的Cas9转基因小麦的不同靶点实现高效的可遗传基因编辑，总体效率可达46.2%-68.9%。而融合了tRNA或FT可移动RNA元件的改造载体，可遗传基因编辑效率反而显著降低。此外，RT-PCR结果表明,大部分发生编辑的M1代植株不再包含BSMV(virus-free)(图3)。
图3.BSMV-sg系统可在多个小麦品种中实现高效的可遗传基因编辑
4.M1代中包含的嵌合突变的可遗传性分析
利用BSMV-sg得到的M1代突变体植株中,有一部分是嵌合突变株。分析发现，M1代中的嵌合突变，根据编辑效率可以划分为三类，Chi-1(编辑效率为15.0-35.0%)，Chi-2(编辑效率为35.1-65.0%)和Chi-3(编辑效率为65.1-.0%)。其中Chi-2和Chi-3嵌合突变占据了大部分。对M2代植株的分析发现，当M1代的嵌合突变类型为Chi-1时，其突变无法继续传递至M2代；而M1代为Chi-2和Chi-3类型的嵌合突变，依然可以有效传递至M2代(图4)。
图4.M1代中大部分的嵌合突变可以继续传递至M2代
5.可实现可遗传的多基因编辑
多基因编辑在研究基因信号通路及实现多重性状改良和叠加等方面都具有重要价值。为此，将携带不同sgRNA的BSMV-sg载体的农杆菌混合后，共同接种本氏烟草并转接Cas9转基因小麦以尝试同时编辑多个不同的基因(图5A)。设计了两种多基因组合(MEA2T和MEA3T)，分别用于同时编辑两个(TaPDS和TaGASR7)靶标基因以及同时编辑三个靶标基因(TaPDS、TaGASR7和TaGW2)。在M0代植物的系统发病叶中，MEA2T和MEA3T组合均可以实现高效的多基因编辑(图5B和5C)。而对于M1代，MEA2T和MEA3T组合均可以实现2个不同靶标基因的可遗传基因编辑，例如，在2T-2和3T-32个株系中，2个基因同时发生可遗传编辑的效率接近50%(图5D)。在部分发生可遗传、多基因编辑的M1代植株还检测到纯合突变(图5E)。
图5.BSMV-sg系统可实现可遗传的多基因编辑
6.通过VITF-Edit技术获得Cas9-free的突变体子代植株
受限于BSMV的外源片段承载量，需要使用Cas9转基因的小麦用于提供Cas9蛋白。为了尽快地将突变体子代植株中的Cas9转基因成分分离出去，设计了一种称为“病*引导的无转基因编辑(virus-inducedtransgene-freeEdit,VITF-Edit)”的方法。通过将BSMV-sg侵染的Cas9转基因小麦花粉与野生型小麦进行杂交，在F2代可以获得不含Cas9(Cas9-free)的突变体后代(图6)。
图6.利用VITF-Edit策略获得Cas9-free的突变体植株
综上所述，该研究利用基于BSMV的VMGE载体系统BSMV-sg,首次在小麦中实现了不依赖于组培和再生的基因编辑,绕开了遗传转化、组培和再生过程,可直接收获种子获得靶基因编辑且不含病*的子代植株。通过混合接种含有不同sgRNA的BSMV-sg载体,可在Cas9转基因小麦中实现可遗传的多基因编辑。此外，BSMV-sg系统还可对Cas9转基因小麦的花药进行编辑，借助于VITF-Edit技术，可以获得Cas9-free的突变体植株。
中科院遗传发育所高彩霞组博士生李停栋(现为西北农林科技大学农学院青年教授)和中国农业大学生物学院张永亮组博士生胡佳成(现为高彩霞团队博士后)为该论文的共同 作者，中科院遗传发育所青年研究员王延鹏和中国农业大学张永亮教授为该论文的共同通讯作者。该研究得到了中国科学院战略性先导专项A、国家自然科学基金、农业生物技术国家重点实验室开放课题以及中科院青年促进会项目的资助。
参考文献:
Ellison,E.E.,Nagalakshmi,U.,Gamo,M.E.,Huang,P.J.,Dinesh-Kumar,S.,andVoytas,D.F.().MultiplexedheritablegeneeditingusingRNAvirusesandmobilesingle-guideRNAs.Nat.Plants6,-.
Gao,C.().Genomeengineeringforcropimprovementandfutureagriculture.Cell,-.
Hu,J.,Li,S.,Li,Z.,Li,H.,Song,W.,Zhao,H.,Lai,J.,Xia,L.,Li,D.,andZhang,Y.().ABarleystripemosaicvirus-basedguideRNAdeliverysystemfortargetedmutagenesisinwheatandmaize.Mol.PlantPathol.20,-.
Ma,X.,Zhang,X.,Liu,H.,andLi,Z.().HighlyefficientDNA-freeplantgenomeeditingusingvirallydeliveredCRISPR-Cas9.Nat.Plants6,-.
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