年7月16日，美国堪萨斯州立大学植物病理学学系的AkhunovEduard团队在国际知名期刊PlantBiotechnologyJournal在线发表题为“ExpandingtherangeofeditabletargetsinthewheatgenomeusingthevariantsoftheCas12aandCas9nucleases”的研究论文，该研究利用Cas12a和Cas9核酸酶变体，与野生型Cas9相比进一步扩大了小麦基因组中可编辑靶标的范围。在使用CRISPR/Cas系统进行基因组编辑时，需要考虑的重要因素之一是目的基因是否具有可用的PAM序列。Cas9编辑器可识别G-rich的NGGPAM序列，识别TTTV或TTV的Cas12a核酸酶和识别NG的xCas9和Cas9-NG核酸酶允许在可能缺乏SpCas9所需的PAM区域进行基因组编辑，进一步扩大了编辑目标靶点的数量。目前，CRISPR/Cas12a系统已经在拟南芥、水稻、大豆和烟草等不同植物种类中得到了广泛的应用。研究发现在大多数情况下，LbCas12a（LachnospiraceaebacteriumND）的基因编辑效率 。多重基因组编辑(MGE)的效率是选择CRISPR/Cas系统时另一个重要考虑因素。利用CRISPR/Cas9系统对基因组中的多个靶点进行编辑，多个gRNA应从各自的独立启动子中表达，或者作为一个长串联gRNA阵列表达。CRISPR/Cas12a系统中crRNAs的短长度使其成为一个理想的MGE工具，目前已被成功地应用于编辑水稻等不同物种的基因组。在本研究中，作者首先比较了LbCas12a和FnCas12a对小麦基因组的编辑效率。在小麦原生质体中利用LbCas12a对11个靶点的 平均编辑效率达到23.8%，诱导的大多数突变是位于PAM远端超过3bp的缺失，但在相同的靶标位点未检测到FnCas12a诱导的突变，在对4个内源基因的编辑检测中发现SpCas9的编辑效率远高于LbCas12a（图1）。
图1LbCas12a，而不是FnCas12a诱导小麦基因组突变
随后，作者评估了CRISPR/Cas12a系统在多重基因组编辑方面的应用。通过使用3、4或8个crRNA单位的串联阵列的构造，发现在小麦原生质体中LbCas12aMGE的编辑效率基本上与单纯RNA引导的编辑效率相当。当转基因植物经过高温处理后，Cas12aMGE的效率显著提高。Cas12a编辑后代TaGW7-B1纯合突变体与T2代的野生型植物相比，千粒重增加了2%，我们成功地应用LbCas12a-MGE在控制小麦粒度和重量的基因中产生可遗传突变。图2用单个和多个crRNA单元构建的CRISPR-LbCas12a的基因编辑效率
以上研究结果显示对于大多数基因使用CRISPR-LbCas12a的9LCCnv结构的编辑效率明显低于CRISPR/Cas9。因此，作者进一步研究了不同结构设计对LbCas12a编辑效率的影响。作者构建了一个pA9LbCas12acr-enhanced(9LCCe)载体，由直接重复序列(DR)和两侧的核酶组成crRNA单元，该系统由柳枝稷（switchgrass）泛素启动子(PvUbip)驱动。与TaU6启动子(9LCCnv结构)驱动的编辑系统相比，在SPL16T2和GW2T6位点由PvUbip启动子表达的9LCCe系统编辑效率分别提高了3倍和8倍。进一步证明发现GE效率的提高很可能与双核酶系统而不是PvUbip启动子和DR的添加有关。同时使用密码子优化的Cas12a系统也没有明显提高GE效率（图3）。图3不同结构设计提高LbCas12a的基因编辑效率
为了扩大了LbCas12a的编辑能力，我们创建了一个可以识别TATVPAM的LbCas12a-RVR（GR、KV和YR）变体， GE效率可达到3.1%，没有检测到相应的脱靶（图4）。随后，作者又比较了不同基因位点使用xCas9和Cas9-NG的编辑情况，但对PAM也具有一定的偏好性，Cas9-NG在具有典型PAM的靶标上显示出比xCas9更高的编辑效率（图5）。图4LbCas12a变体诱导小麦基因组突变
图5小麦基因组中Cas9变体编辑效率
综上，研究者成功地应用了Cas12a和Cas9核酸酶的天然和工程化变体LbCas12a-RVR、xCas9、Cas9-NG，用于小麦的基因组编辑，扩大了基因组编辑的范围。通过对LbCas12acrRNA单元两侧添加核酶的优化，对转基因植株的高温处理，进一步提高了多重基因组编辑的效率。通过使用LbCas12a核酸酶结合多重crRNA，创造了稳定的小麦突变体，增加了籽粒大小和重量。同时，作者还强调了对新开发的基于CRISPR-Cas的基因组编辑技术进行系统测试和优化的重要性，以创建一个特定作物的定制工具包，以有效地实现不同的基因组编辑策略，以改善农艺性状。原文链接：